DNA序列分析軟件Sequencher的Next-Generation Sequencing功能

gene codes致力于為您帶來(lái)在**評(píng)審期刊上開(kāi)發(fā)和發(fā)布的各種比對(duì)和組裝算法，但讓非工程師也可以使用它們。例如，gsnap（tom wu，genentech，inc.）被認(rèn)為是正確識(shí)別剪接點(diǎn)的算法之一。生物信息學(xué)可能會(huì)像這樣調(diào)用該程序：
如果我們有一些工具來(lái)幫助我們了解所有可用的標(biāo)志和參數(shù)是什么以及它們?nèi)绾斡绊懗绦?，那么我們大多?shù)人的工作效率都會(huì)高。sequencher界面可幫助您選擇選項(xiàng)、設(shè)置值并通過(guò)說(shuō)明和工具提示了解可用功能。上面指令行中的相同選項(xiàng)在sequencher中設(shè)置如下：
只需幾個(gè)步驟即可執(zhí)行snp分析、甲基化分析或rna a-to-g耐受比對(duì)。
在平板電腦中查看您的結(jié)果 。
bwa、velvet、maq、gsnap和tablet只是sequencher的開(kāi)始。如果您要對(duì)混合群體進(jìn)行測(cè)序，請(qǐng)將參考引導(dǎo)比對(duì)與從頭組裝的力量結(jié)合起來(lái)。將讀數(shù)與參考比對(duì)并捕獲未比對(duì)的讀數(shù)，以進(jìn)行進(jìn)一步的基于參考的比對(duì)或從頭組裝。
通過(guò)添加cufflinks套件，您可以使用我們?yōu)樗衝gs算法開(kāi)發(fā)的相同風(fēng)格的界面來(lái)執(zhí)行rna-seq差異表達(dá)。
我們還添加了您期望看到的圖表，例如火山圖，因此您*借助指令行即可查看結(jié)果。因?yàn)槲覀冎滥凶约合矚g的矯正器，所以我們不會(huì)堅(jiān)持您使用我們的。只要您的對(duì)齊器創(chuàng)建sam或bam作為其輸出，您就可以使用廣泛認(rèn)可的rna-seq工具之一來(lái)探索您的數(shù)據(jù)。
fastqc質(zhì)量控制報(bào)告
在開(kāi)始調(diào)整數(shù)據(jù)之前，請(qǐng)停下來(lái)考慮一下。您不想知道您的數(shù)據(jù)有多好嗎？好吧，現(xiàn)在您可以使用fastq質(zhì)量報(bào)告。我們已將流行的fastqc程序集成到sequencher中。從“序列”>“分析”>“fastq質(zhì)量報(bào)告...”啟動(dòng)，您可以獲得多達(dá)12個(gè)不同指標(biāo)的結(jié)果。從“每堿基序列質(zhì)量”到“kmer內(nèi)容”，從“序列重復(fù)水平”到“過(guò)度代表性序列”，結(jié)果以易于理解的交通燈系統(tǒng)以及詳細(xì)的圖形形式呈現(xiàn)。
每個(gè)報(bào)告都顯示在自己的窗口中，以便您可以并排查看它們。使用報(bào)告在組裝之前監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)集的單獨(dú)質(zhì)量或隨著時(shí)間的推移監(jiān)控質(zhì)量。
rna測(cè)序
rna-seq實(shí)驗(yàn)為蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的研究帶來(lái)了新的理解和知識(shí)，無(wú)論是來(lái)自不同時(shí)間點(diǎn)的正常組織還是正常與生病狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)錄本。sequencher插件家族的新成員是cufflinks套件，一系列專為研究rna-seq ngs數(shù)據(jù)而設(shè)計(jì)的程序。入門再簡(jiǎn)單不過(guò)了。
使用您喜歡的比對(duì)器將您的rna-seq ngs數(shù)據(jù)與參考序列比對(duì)，然后獲取生成的sam或bam文件以及參考gtf文件以開(kāi)始使用 cufflinks。
關(guān)鍵是利用cufflinks、cuffmerge、cuffdiff的四步過(guò)程進(jìn)行差異表達(dá)，然后將數(shù)據(jù)顯示為表格和繪圖。cufflinks套件指令行程序都可以使用我們易于使用的圖形界面進(jìn)行訪問(wèn)。為了實(shí)現(xiàn)控制，您還可以通過(guò)簡(jiǎn)單的點(diǎn)擊“高等（編輯）”對(duì)話框來(lái)訪問(wèn)所有高等指令行功能。
您可以在sequencher中運(yùn)行分析并以繪圖形式查看結(jié)果。通常，差異表達(dá)需要您從指令行安裝并使用r統(tǒng)計(jì)編程語(yǔ)言。
我們?yōu)槟峁┮粋€(gè)菜單指令，允許您使用火山圖、散點(diǎn)圖和條形圖顯示結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)或條都鏈接到其基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，因此您可以單擊您感興趣的點(diǎn)或條并詳細(xì)探索結(jié)果。
sequencher中的cufflinks套件現(xiàn)在包括cuffquant和cuffnorm。如果您不處理差異表達(dá)基因但仍需要標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，請(qǐng)?jiān)?cufflinks步驟后使用cuffquant和cuffnorm。如果您需要減少計(jì)算機(jī)上的計(jì)算負(fù)載，可以在cufflinks和cuffmerge步驟之后使用 cuffquant來(lái)量化數(shù)據(jù)集中的讀數(shù)。然后，當(dāng)您準(zhǔn)備好時(shí)，使用cuffdiff完成差異分析。您會(huì)發(fā)現(xiàn)這一步要快得多，因?yàn)槟遣糠止ぷ饕呀?jīng)完成。
通過(guò)基因名稱或基因id搜索數(shù)據(jù)表，快速找到您感興趣的數(shù)據(jù)。
對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序和篩選，僅繪制您感興趣的數(shù)據(jù)，然后以png格式導(dǎo)出圖表以包含在演示文稿或報(bào)告中。
de novo組裝
velvet在5.1版中加入了不斷壯大的sequencher插件家族。velvet是一個(gè)從頭匯編器，它不需要參考序列。雖然我們談?wù)搗elvet，但它實(shí)際上由兩個(gè)程序組成。velveth準(zhǔn)備您的數(shù)據(jù)集，而velvetg使用一種稱為de bruijn圖的方法執(zhí)行組裝步驟。velvetg構(gòu)建重疊群，甚至?xí)L試搭建那些無(wú)法自行組合在一起的重疊群。
velvet可以使用multiplex id數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝。sequencher自動(dòng)按條形碼將數(shù)據(jù)劃分為單獨(dú)的文件（箱），然后對(duì)齊它們并將結(jié)果放入單獨(dú)的結(jié)果文件夾中。然后可以在平板電腦瀏覽器中查看結(jié)果。每個(gè)重疊群的共有序列將出現(xiàn)在您的項(xiàng)目窗口中。
velvet被編寫為在指令行上運(yùn)行。sequencher使您只需單擊幾下即可輕松啟動(dòng)程序集運(yùn)行，從而保護(hù)您免受指令行的影響。高等用戶和新手仍然可以訪問(wèn)指令行參數(shù)來(lái)添加或改參數(shù)，我們引入了一個(gè)新的gui，讓您也可以訪問(wèn)和利用這些參數(shù)。
參考引導(dǎo)對(duì)齊
比對(duì)人員花費(fèi)一部分時(shí)間對(duì)參考序列進(jìn)行索引，以加快整體比對(duì)速度?，F(xiàn)在，您可以創(chuàng)建并保留這些索引 (bwa) 或數(shù)據(jù)庫(kù) (gsnap)，當(dāng)您想要嘗試不同的參數(shù)以改進(jìn)對(duì)齊或拼接位置時(shí)，速度會(huì)快。
索引和數(shù)據(jù)庫(kù)文件是跨平臺(tái)的，因此您可以與不同類型計(jì)算機(jī)上的協(xié)作者共享它們。當(dāng)您創(chuàng)建新索引或數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，它將自動(dòng)出現(xiàn)在該比對(duì)器的可用參考序列列表中，可供隨時(shí)使用。sequencher會(huì)記住它的位置，因此您*記住它。
來(lái)自預(yù)處理參考的文件可能會(huì)變得很大。當(dāng)您不再使用某個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)，只需使用外部數(shù)據(jù)瀏覽器一鍵刪除即可。您將節(jié)省磁盤空間，并且如果您需要再次索引相同的參考序列，sequencher可以輕松地重新創(chuàng)建它。
bwa
bwa在5.2版本中加入了sequencher插件系列。sequencher使用bwa-mem，這是bwa軟件包中新、快的算法。bwa-mem旨在將70bp到1mbp的序列讀數(shù)與參考比對(duì)。
bwa被編寫為在指令行上運(yùn)行。sequencher為您提供了一個(gè)易于使用的界面，使您*使用指令行，也*學(xué)習(xí)或使用指令行參數(shù)。對(duì)于想要訪問(wèn)這些指令行功能的高等用戶來(lái)說(shuō)，“高等（編輯）”對(duì)話框也可以讓您利用這些功能。
gsnap
gsnap在5.0版中加入了sequencher插件系列。gsnap通過(guò)壓縮參考序列，使用基于參考的對(duì)齊方法。這使得gsnap在執(zhí)行下一代測(cè)序時(shí)變得快、容易。
gsnap旨在對(duì)雙端和不雙端的illumina-solexa或sanger標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)執(zhí)行基于參考的比對(duì)。序列的長(zhǎng)度對(duì)于gsnap來(lái)說(shuō)不是問(wèn)題，因?yàn)樗軌蜉p松對(duì)齊很短到任意長(zhǎng)的數(shù)據(jù)長(zhǎng)度。
gsnap現(xiàn)在可以處理multiplex id (mid) 數(shù)據(jù)，從而進(jìn)一步很大限度地提高效率?，F(xiàn)在您擁有了sequencher的用戶友好界面，它允許您通過(guò)mid數(shù)據(jù)利用 gsnap 的功能。sequencher自動(dòng)將數(shù)據(jù)按條形碼劃分為單獨(dú)的文件，使用gsnap將這些文件與參考對(duì)齊，并將結(jié)果放入單獨(dú)的結(jié)果文件夾中。
任意與gsnap對(duì)齊的結(jié)果都可以在流行的平板電腦瀏覽器中查看。
對(duì)于想要好地控制gsnap指令行功能的高等用戶，請(qǐng)按“高等（編輯）”打開(kāi)“高等gsnap 選項(xiàng)”對(duì)話框，您可以在其中配置特定的指令行參數(shù)。
maq
maq在5.0版本中加入了sequencher插件系列。流行的maq算法將單端和雙端下一代數(shù)據(jù)與參考序列對(duì)齊。開(kāi)始設(shè)計(jì)用于對(duì)齊 illumina-solexa 數(shù)據(jù)，它將對(duì)齊任意很短的讀取數(shù)據(jù)（63個(gè)堿基或少）。參考序列可以是fasta或genbank文件的形式。maq使用二進(jìn)制格式來(lái)壓縮引用并讀取文件。關(guān)鍵的是，maq運(yùn)行所需的ram很少，這使得執(zhí)行下一代測(cè)序變得加容易。它也適用于大約200萬(wàn)次讀取的小型項(xiàng)目，盡管可以將較大的項(xiàng)目分解然后稍后合并結(jié)果。
比對(duì)結(jié)果可以在maqview或tablet中查看。
maq開(kāi)始是為了在指令行上運(yùn)行而編寫的。sequencher 提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、易于使用的界面，可以保護(hù)您免受指令行的影響，也不必學(xué)習(xí)如何使用指令行參數(shù)。
使用samtools進(jìn)行變體調(diào)用
您已經(jīng)對(duì)它進(jìn)行了測(cè)序，現(xiàn)在您已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了對(duì)齊。接下來(lái)使用新的變體調(diào)用功能檢查變體的比對(duì)。無(wú)論您是使用我們的參考引導(dǎo)比對(duì)器之一比對(duì)讀數(shù)，還是在其他地方獲取比對(duì)的sam/bam文件，您仍然可以使用samtools的變體調(diào)用來(lái)檢查變體。
該分析可以在snp耐受比對(duì)、甲基化耐受比對(duì)或gsnap中新的rna a-to-i編輯耐受模式之后使用。然后將生成的vcf文件和 sam文件加載到您喜歡的瀏覽器中（如果您沒(méi)有試用平板電腦）——它是我們dna-seq工具發(fā)行版的一部分。向平板電腦提供gtf文件進(jìn)行注釋，您還可以看到功能中的變體。
multiplex id
sequencher 5.2及高版本使用bwa、gsnap或velvet的從頭或基于參考的組裝的復(fù)用方法。多路復(fù)用既快速又簡(jiǎn)單。每個(gè) dna樣本都有一個(gè)與其相關(guān)的特定條形碼。sequencher可以讀取這些條形碼并將數(shù)據(jù)劃分到各種文件或“容器”中。然后，sequencher獲取每個(gè)“bin”中的序列并為您執(zhí)行組裝或比對(duì)。sequencher的multiplex id可與單端或雙端數(shù)據(jù)一起使用。對(duì)于成對(duì)末端數(shù)據(jù)，成對(duì)中的每個(gè)讀取都必須在 5' 端具有相同的條形碼才能被識(shí)別為成對(duì)。您可以使用平板電腦查看器查看多重組裝或比對(duì)的結(jié)果。
snp分析
在尋找候選snp時(shí)，篩選下一代測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)百萬(wàn)條讀數(shù)是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。maq和gsnap算法都包含snp篩選功能。
maq有一個(gè)兩級(jí)篩選過(guò)程，首先搜索讀數(shù)和參考序列之間的差異。接下來(lái)，進(jìn)行過(guò)濾步驟，篩選初始結(jié)果，尋找每列讀數(shù)的同一類別的小數(shù)量的變體，以及嵌入高質(zhì)量區(qū)域的變體。結(jié)果以綜合報(bào)告形式呈現(xiàn)。您還可以在maqview或平板電腦中查看結(jié)果。
通過(guò)gsnap，snp分析采用不同的方法來(lái)查看先前報(bào)告的snp以及新的候選者。用戶必須提供已知snp的列表以及讀數(shù)和參考序列。gsnap對(duì)所有主要和次要等位基因執(zhí)行snp耐受比對(duì)。該算法能夠區(qū)分次要等位基因和不匹配。結(jié)果以綜合報(bào)告形式呈現(xiàn)。您還可以在平板電腦中查看結(jié)果。
methylation studies
幾十年來(lái)，dna甲基化一直被認(rèn)為在基因表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)dna用亞硫酸氫鹽處理時(shí)，任意胞嘧啶都會(huì)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，除非胞嘧啶已被甲基化。gsnap將從亞硫酸氫鹽處理的dna測(cè)序中獲取的下一代測(cè)序讀數(shù)與參考序列進(jìn)行比對(duì)，其比對(duì)方式不會(huì)掩蓋真正的錯(cuò)配，但仍會(huì)暴露用亞硫酸氫鹽處理未甲基化dna時(shí)發(fā)生的c到t錯(cuò)配。
rna耐受比對(duì)
gsnap已新，現(xiàn)在包含a到g的容忍對(duì)齊模式。如果您的mrna可能已被adar基因編輯，導(dǎo)致腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，請(qǐng)使用此模式。測(cè)序時(shí)i被視為g。
該版本還引入了鏈鏈和非鏈模式，用于新的rna耐受模式和甲基化分析。當(dāng)您的實(shí)驗(yàn)室方案允許 5' 到3' 基因組讀取及其每條鏈上的反向互補(bǔ)時(shí)，請(qǐng)使用非鏈模式。
viewers
tablet是用于下一代序列比對(duì)的高性能查看器。在多種不同模式下查看和檢查您的maq、gsnap、bwa-mem或velvet結(jié)果，以不同顏色**顯示堿基并讀取方向。獲取有關(guān)單個(gè)讀數(shù)和讀數(shù)對(duì)的信息，并安排讀數(shù)的堆疊以揭示配對(duì)。平板電腦具有用于啟用翻譯、放大和縮小以及**顯示變體堿基的控件，使您可以輕松探索閱讀內(nèi)容。
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